dott. Marco David, prof. Mauro Giacca e dott.ssa Serena Zacchigna – International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (ICGEB), Trieste
La vita si è allungata, e questo naturalmente è un dato positivo. Ma con essa molti nostri organi vanno incontro alle malattie degenerative. Quali soluzioni?
“Non preoccuparti del tuo cuore, durerà finché vivrai” diceva W.C. Fields, un attore comico statunitense degli inizi del Novecento. Oggi, invece, ci dicono che ce ne dobbiamo preoccupare. Soprattutto a seguito del progressivo allungamento della vita cui abbiamo assistito durante l’ultimo secolo, molti dei nostri organi, incapaci di rigenerarsi, tendono ad andare incontro alle cosiddette malattie degenerative. Il cuore è uno di questi e la sua disfunzione rappresenta oggi la prima causa di morte in tutto il mondo, provocando il decesso di una persona su tre (dati Organizzazione Mondiale della Sanità 2014). Questo succede perché, ogniqualvolta si vengono a perdere dei cardiomiociti, ad esempio in conseguenza ad un infarto acuto del miocardio oppure a seguito di un’infezione, l’assenza di capacità rigenerativa fa sì che, al posto del tessuto contrattile, si venga a formare un tessuto connettivo, fibroso, simile ad una cicatrice cutanea. Un cuore con una cicatrice infartuale, incapace di contrarsi e priva di elasticità, non è più in grado di funzionare in maniera efficiente. Progressivamente, si sfianca, fino a causare la tipica sindrome dello scompenso cardiaco. Il paziente inizia ad accusare edema agli arti inferiori, dispnea durante lo sforzo fisico o in posizione supina e astenia progressiva. Questo quadro clinico affligge oggi il 10-20% degli individui di età superiore ai 70 anni, con un numero di nuovi casi all’anno superiore ai 15 milioni in tutto il mondo. La prognosi è decisamente severa, peggiore della maggior parte dei tumori: più della metà dei pazienti muore entro 5 anni dalla diagnosi.
Nuove terapie per le malattie cardiache
A fronte di un quadro clinico così allarmante, i progressi della medicina degli ultimi decenni si sono focalizzati essenzialmente a migliorare la tempestività dell’intervento medico, a promuovere la rivascolarizzazione precoce del miocardio ischemico e a normalizzare il ritmo cardiaco. Al contrario, i progressi farmacologici non sono stati altrettanto entusiasmanti. Con l’eccezione del sacubitril, l’inibitore della neprilisina recentemente proposto come nuovo paradigma nella cura dello scompenso cardiaco, i farmaci comunemente utilizzati per questa patologia risalgono ad almeno 20 anni fa. Comunque, non disponiamo di alcun composto farmacologico in grado di stimolare la rigenerazione dei cardiomiociti. Quest’ultimo, ambizioso obiettivo sembra più facilmente perseguibile dalle nuove biotecnologie, con lo sviluppo di farmaci basati su proteine (fattori di crescita), acidi nucleici (DNA, RNA) o cellule (cellule staminali di vario tipo) in grado di instaurare dei programmi biologici tali da portare al ripristino del miocardio danneggiato.
Il potenziale proliferativo del cuore
Il cuore è il primo organo che si forma durante lo sviluppo embrionale e si accresce grazie alla rapida replicazione dei cardiomiociti. Nell’uomo, e nei mammiferi in generale, i cardiomiociti smettono di proliferare pochi giorni dopo la nascita. Sono ancora in grado di duplicare il DNA e dividere il nucleo, ma non di dividere il citoplasma. Ne risulta una popolazione di cellule multinucleate, verosimilmente incapaci di proliferare ulteriormente. Nell’adulto, il cuore è ancora in grado di aumentare le proprie dimensioni, ma ciò avviene essenzialmente mediante ipertrofia dei cardiomiociti, il cui numero permane pressoché invariato per tutta la vita dell’individuo.
Tutto ciò, però, non accade in ogni specie. Esistono, infatti, piccoli anfibi e pesci che, a differenza dei mammiferi, conservano la capacità di rigenerare completamente il cuore anche in età adulta. La rimozione dell’apice cardiaco in questi animali è seguita dalla generazione di nuovo tessuto muscolare perfettamente funzionante. Nei tritoni e in zebrafish (Danio Rerio), uno dei modelli animali più studiati per la medicina rigenerativa, la riparazione del tessuto cardiaco avviene grazie all’attiva replicazione di cardiomiociti maturi capaci di tornare indietro nel proprio stato di differenziamento, rilassando la struttura dell’apparato contrattile e riprendendo a proliferare. È curioso osservare che la quantità di cellule multinucleate nei cuori di pesci e anfibi è nettamente inferiore a quella che si riscontra nei mammiferi. Ciò suggerisce che la capacità rigenerativa del tessuto cardiaco possa essere direttamente proporzionale al numero di cardiomiociti mononucleati.
In alcuni mammiferi di piccola taglia, come il ratto e il topo, il potenziale proliferativo del muscolo cardiaco si mantiene per alcuni giorni dopo la nascita. L’induzione di un infarto del miocardio o, addirittura, la resezione dell’intero apice cardiaco in un topo neonato (fino a 5-7 giorni dopo la nascita) vengono sorprendentemente riparate da un processo rigenerativo che non lascia tracce, senza la formazione di cicatrice fibrosa. Analogamente a quanto osservato in pesci e anfibi, anche il cuore dei roditori neonati è formato prevalentemente da cardiomiociti mononucleati, i quali, successivamente, aumentano il numero di nuclei (ploidia) parallelamente alla perdita di capacità rigenerativa.
Il nostro cuore sembra, dunque, essere destinato a mantenere lo stesso numero di cellule formatesi durante lo sviluppo e nei primi giorni di vita. Tuttavia, questo concetto oggi è messo seriamente in discussione. Nel 2012, a Boston, è stato dimostrato che, nel cuore di un topo adulto, esistono dei cardiomiociti capaci di replicare, in linea con quanto osservato alcuni anni prima da Olaf Bergmann a Stoccolma nel cuore umano. Si stima che, nell’arco della propria vita, ogni individuo rinnovi circa il 50% dei cardiomiociti: in un giovane di 25 anni, ogni anno prolifera l’1% dei cardiomiociti. Tale percentuale si riduce a 0,45% in un individuo di 75 anni. Questo reale, ma limitato potenziale proliferativo rimane comunque insufficiente a garantire la rigenerazione del cuore a seguito di un danno. In realtà, in condizioni di stress e di danno, come, ad esempio, dopo un infarto, i cardiomiociti aumentano la sintesi di DNA come se si stessero preparando alla divisione cellulare. Tuttavia, questa, per motivi ancora poco chiari, non avviene in maniera efficiente.
Di fronte a queste osservazioni, una domanda sorge spontanea: è possibile riuscire a sbloccare quest’ingranaggio in modo che il macchinario proliferativo dei cardiomiociti torni a funzionare come durante lo sviluppo? É possibile, quindi, pensare di rigenerare un cuore danneggiato?
Le cellule staminali per la rigenerazione cardiaca
I primi tentativi di rigenerare il cuore hanno utilizzato cellule staminali impiantate direttamente nel miocardio per generare nuovi cardiomiociti, vasi sanguigni e cellule di supporto. Le cellule staminali embrionali (ES) sono gli elementi staminali per eccellenza, in grado di replicarsi illimitatamente e capaci di dare origine ad ogni tipo di tessuto presente nel nostro organismo (totipotenti). Le cellule ES sono derivate dall’embrione in fase di blastocisti, costituita da una massa di circa 200-300 cellule. Essendo staminali e totipotenti, queste cellule possono essere indotte a differenziare in cardiomiociti. Garantirebbero, quindi, una sorgente pressoché illimitata di elementi cellulari da trapiantare dopo un danno. Tuttavia, l’utilizzo clinico delle cellule ES comporta una serie di problematiche ad oggi insormontabili. In primis, queste cellule sono intrise di un potenziale tumorigenico preoccupante: se impiantate in un cuore adulto, formano un bizzarro tumore (teratoma) composto da molteplici tipi cellulari, più o meno differenziati a formare osso, cartilagine, intestino, cute e annessi, ecc. Inoltre, per definizione, le cellule ES non possono essere autologhe. Sono, quindi, soggette a rigetto, analogamente a qualsiasi organo trapiantato. Infine, la terapia basata su cellule ES presenta importanti implicazioni etiche, in quanto richiede la manipolazione e la distruzione dell’embrione per uso sperimentale. Con l’elezione di Barack Obama nel 2009, negli USA è stato autorizzato l’utilizzo di embrioni umani congelati per la produzione di cellule ES a fini di ricerca. Una politica simile era già stata attuata in diverse Nazioni europee ed asiatiche, ma in Italia sono ancora molti gli ostacoli legislativi che impediscono il progresso in tale direzione. Paradossalmente, la legislazione italiana vieta l’utilizzo di embrioni per produrre cellule ES, ma consente l’utilizzo di cellule ES importate da altri Paesi.
Molte di queste limitazioni potrebbero essere sorpassate grazie al lavoro di Shinya Yamanaka: nel 2006, a San Francisco, è riuscito a convertire delle cellule somatiche differenziate, in particolare dei fibroblasti cutanei, in cellule staminali analoghe a quelle embrionali mediante il trasferimento di quattro geni (Oct3/Oct4, Sox2, Klf4 e c-myc). Le cellule staminali così ottenute sono state chiamate cellule staminali pluripotenti indotte (induced pluripotent stem-cells, iPS) e rappresentano un’attraente alternativa alle cellule ES, in quanto non derivate da embrioni e di possibile origine autologa.
Le cellule ES e iPS non sono, però, le uniche dotate di caratteristiche staminali: nel nostro organismo, diversi tessuti, come l’epidermide o il midollo osseo, sono dotati di un contingente di cellule indifferenziate, caratterizzate da una spiccata capacità replicativa. Queste cellule staminali “adulte” sono in grado di differenziare in una varietà limitata di cellule (pluripotenti), condizionata dal tessuto in cui si trovano. Assicurano il turn-over tissutale negli organismi adulti ed hanno vissuto un periodo di estrema fama una quindicina di anni fa, quando diverse evidenze sperimentali ne hanno indicato una notevole plasticità. Ad esempio, esperimenti condotti nel laboratorio di Piero Anversa, a New York, hanno suggerito che le cellule staminali ematopoietiche estratte dal midollo osseo, se impiantate in un cuore infartuato, erano in grado di rigenerare fino al 70% del tessuto danneggiato, formando nuovi cardiomiociti ed anche cellule endoteliali e muscolari lisce. Sulla base di queste evidenze è partita la sperimentazione clinica, arruolando centinaia di pazienti affetti da scompenso cardiaco e pazienti post-infartuati trattati con cellule staminali ematopoietiche estratte dal proprio midollo osseo. A dispetto dei risultati promettenti ottenuti dalla sperimentazione animale, la trasposizione clinica si è rivelata deludente: al momento, non sussiste alcuna solida prova che nell’uomo le cellule di origine midollare, una volta inoculate nel muscolo cardiaco, si trasformino in nuovi cardiomiociti. A smorzare ulteriormente l’entusiasmo nei confronti di tale approccio, studi più recenti hanno chiaramente smentito la capacità delle cellule staminali derivate da midollo di differenziare in senso cardiomiocitario. L’ipotesi attualmente più plausibile è che il reale, ma modesto beneficio osservato nei cuori trattati sia dovuto alla secrezione di fattori di crescita e citochine in grado di promuovere sopravvivenza e angiogenesi in maniera paracrina.
Nell’ultimo decennio, cellule con proprietà staminali sono state identificate anche nel muscolo cardiaco adulto (Cardiac Derived Stem Cells, CDCs). Le CDCs, isolate da biopsie cardiache e impiantate in modelli animali di infarto del miocardio, appaiono in grado di differenziarsi in cardiomiociti e sostenere la rigenerazione cardiaca. Attualmente, due studi clinici sono in corso per validare le potenzialità di queste cellule nell’uomo: lo studio SCIPIO, coordinato dallo stesso Anversa, e lo studio CADUCEUS. Entrambi prevedono il trattamento di pazienti affetti da cardiopatia ischemica o scompenso cardiaco con l’impianto di CDCs isolate da biopsie cardiache, precedentemente prelevate dai medesimi pazienti. I risultati finora raggiunti sono promettenti. Rimane, tuttavia, ancora da confermare se, e in che misura, il beneficio osservato sia effettivamente da ascrivere ad una reale rigenerazione del tessuto cardiaco.
Piccoli RNA in grado di promuovere la proliferazione dei cardiomiociti
Nonostante il fascino della terapia cellulare con elementi staminali, non possiamo ignorare la scarsa applicabilità di una simile strategia su larga scala, soprattutto considerando la prevalenza delle malattie cardiovascolari ormai in tutto il mondo. Si tratta di procedure molto costose, che richiedono apparecchiature e strutture dotate di un elevato livello tecnologico, certamente non proponibili in molte realtà cliniche. Una strada decisamente più percorribile sarebbe quella di riuscire ad individuare un farmaco capace di indurre la proliferazione dei cardiomiociti già presenti nel cuore, una molecola idonea ad essere prodotta, distribuita e somministrata con facilità e a basso costo.
L’ipotesi di poter ottenere la rigenerazione del cuore stimolando la proliferazione dei cardiomiociti adulti si basa sulle considerazioni, discusse in precedenza, relative al potenziale proliferativo del miocardio adulto. Per questo scopo, appaiono particolarmente promettenti i farmaci genetici, molecole di DNA o RNA in grado di attivare complesse funzioni biologiche, come, ad esempio, la proliferazione cellulare.
L’impiego di acidi nucleici quali strumenti terapeutici risale alla fine degli anni ’80, quando furono utilizzati per la prima volta per la cura di malattie ereditarie basandosi sull’idea di poter guarire una malattia causata da un difetto genetico veicolando direttamente nelle cellule l’informazione genetica corretta sotto forma di DNA. Oggi, il potenziale della terapia genica si spinge ben oltre. Stiamo, infatti, imparando ad utilizzare i geni come farmaci, non solo per supplire ad una funzione genetica mancante, ma anche per interferire con i meccanismi molecolari che sottendono a diverse patologie. La terapia genica moderna non si limita, inoltre, a trasferire geni classici, codificanti per proteine, ma utilizza anche altre molecole di DNA o RNA dotate di svariate azioni biologiche. Ad esempio, i microRNA (miRNA) sono piccole molecole di RNA, lunghe 21-22 paia di basi, capaci di regolare simultaneamente l’espressione di centinaia di geni bersaglio. Attualmente, si conoscono circa 2.000 miRNA codificati dal genoma umano. Ciascun miRNA è in grado di legare qualsiasi RNA messaggero che contenga una sequenza di nucleotidi complementare ad esso. E’ in grado, così, di interferire con la produzione della relativa proteina. Potendo silenziare contemporaneamente multiple proteine, in genere coinvolte in un medesimo processo biologico, ogni miRNA è potenzialmente un regolatore master, capace di attivare o di spegnere programmi cellulari complessi, quali l’identità funzionale di una cellula, la sua morte, la sopravvivenza o la capacità di proliferare. La scoperta di tale meccanismo molecolare di regolazione dell’espressione genica, denominato interferenza a RNA, ha valso ai suoi scopritori, i ricercatori americani Andrew Fire e Craig Mello, il premio Nobel per la Fisiologia e la Medicina nel 2006.
Dalla loro scoperta, i miRNA sono emersi quali regolatori essenziali in pressoché tutti i fenomeni biologici, inclusi lo sviluppo e la funzionalità dell’apparato cardiovascolare. Il team del laboratorio di Medicina Molecolare dell’ICGEB di Trieste, coordinato da Mauro Giacca, ha recentemente condotto uno screening per identificare miRNA in grado di stimolare la proliferazione dei cardiomiociti al fine di individuare potenziali strumenti terapeutici per ottenere la rigenerazione cardiaca. Sono stati così individuati 40 miRNA capaci di stimolare significativamente la crescita dei cardiomiociti neonatali e adulti in coltura. Alcuni di questi sono stati anche iniettati in vivo. Somministrati ad un animale neonato, questi hanno comportato la formazione di un cuore più grande rispetto al controllo non trattato, eppure strutturalmente normale, con un impressionante aumento di cardiomiociti proliferanti perfettamente integrati nella struttura del muscolo cardiaco. Gli stessi miRNA si sono anche rivelati in grado di stimolare la rigenerazione del tessuto cardiaco a seguito di un infarto acuto, comportando una riduzione della cicatrice ed un significativo miglioramento della funzionalità cardiaca, valutata mediante ecocardiografia.
Complessivamente, i risultati di questo studio sono decisamente incoraggianti, ma la strada da percorrere verso la sperimentazione clinica rimane ancora lunga. Sarà necessario validare l’efficacia dei miRNA in modelli di mammiferi maggiori, come, ad esempio, il cane e il maiale, nonché nei cardiomiociti umani. Considerato l’effetto pro-proliferativo dei miRNA, di primaria importanza sarà anche verificare l’assenza di effetti collaterali, primo fra tutti la possibilità che queste molecole favoriscano la crescita tumorale. Un altro aspetto rilevante sarà l’individuazione della via e della forma di somministrazione più efficaci e sicure. Non potremo, infine, prescindere da una maggiore comprensione dei meccanismi molecolari che sottendono all’azione dei miRNA nell’indurre la proliferazione dei cardiomiociti. Tuttavia, una serie di preziose caratteristiche di questi piccoli RNA, la possibilità di somministrarli senza l’impiego di vettori virali, la loro scarsa immunogenicità e l’assenza d’integrazione nel genoma (che li rendono, quindi, particolarmente sicuri) e il fatto di non esser gravati da problematiche etiche di alcun tipo fanno sì che i miRNA appaiano oggi come un’arma terapeutica unica e particolarmente promettente per la terapia genica e la medicina rigenerativa. Potrebbero essere proprio i miRNA ad aprire le porte allo sviluppo di farmaci che rigenerino un cuore danneggiato.
Per approfondire
Olaf Bergmann, RD Bhardwaj and Samuel Bernard, “Evidence for Cardiomyocyte Renewal in Humans.”, Science 324, n. 5923 (2009): 98–102, doi:10.1126/science.1164680.Evidence.
Eric M Small and Eric N Olson, “Pervasive Roles of microRNAs in Cardiovascular Biology.”, Nature 469 (2011): 336–42, doi:10.1038/nature09783.
Ana Eulalio et al., “Functional Screening Identifies miRNAs Inducing Cardiac Regeneration.”, Nature 492, n. 7429 (December 20, 2012): 376–81, doi:10.1038/nature11739.
Piero Anversa et al., “Regenerating New Heart with Stem Cells.”, The Journal of Clinical Investigation 123 (2013): 62–70, doi:10.1172/JCI63068.
Mei Xin, Eric N Olson, and Rhonda Bassel-Duby, “Mending Broken Hearts: Cardiac Development as a Basis for Adult Heart Regeneration and Repair.”, Nature Reviews. Molecular Cell Biology 14 (2013): 529–41, doi:10.1038/nrm3619.
Marco David è laureato in Medicina e Chirurgia e attualmente collabora con il laboratorio di Medicina Molecolare dell’ICGEB di Trieste per studiare il potenziale ruolo delle proteine del sarcomero nel bloccare la proliferazione dei cardiomiociti adulti.
Mauro Giacca è laureato in Medicina e Chirurgia. Professore di Biologia Molecolare presso il Dipartimento di Scienze Mediche dell’Università degli Studi di Trieste e Direttore Generale dell’ICGEB di Trieste.
Serena Zacchigna è laureata in Medicina e Chirurgia. Titolare del corso “Terapia Genica e Cellule Staminali” presso l’Università degli Studi di Trieste e Staff Scientist nel Laboratorio di Medicina Molecolare dell’ICGEB di Trieste.
